油茶籽饼粕中甲醇提取物抑制黄曲霉菌效果及成(3)

3种萃取相（乙酸乙酯相、正丁醇相和水相）对黄曲霉菌表现出不同的抑制活性（表1）。正丁醇相对黄曲霉菌的生长有明显的抑制效果，且随浓度增大，抑菌效果增强，抑菌圈由25 mg/mL时的15.25 mm增大到100 mg/mL时的22.00 mm。相比之下，水相对黄曲霉的抑菌效果较弱，仅在高浓度（100 mg/mL）时有抑菌效果，抑菌圈直径仅为12.90 mm。乙酸乙酯相对黄曲霉菌生长无抑菌效果，各浓度均无抑菌圈出现。

2.1.2 对菌丝干质量的影响

图1可见，乙酸乙酯相和水相对黄曲霉菌的菌丝生长无明显的抑制效果，相反地，水相在浓度较低（25、33.5 mg/mL）时会促进菌丝的生长。相比之下，正丁醇相明显抑制了黄曲霉菌丝的生长，菌丝干质量显著低于乙酸乙酯相和水相（P<0.01），且随着浓度增大菌丝干质量明显减少，从25 mg/mL时的0.16 g减少到了100 mg/mL时的0.12 g，比对照减少了42.88%，可见，正丁醇萃取相浓度越大，对菌丝的抑制效果越好。

图1 油茶籽粕不同溶剂萃取相对黄曲霉菌丝干质量的影响Fig.1 Mycelial dry weight of A. flavus by different extraction phase extract from camellia seed cake

2.1.3 对黄曲霉菌产毒的影响

液质联用仪检测结果发现（表2），所有样品（乙酸乙酯相、正丁醇相、水相和对照）的PDB培养液中均未检出AFB2，添加乙酸乙酯相和水相的PDB培养液检出了AFB1，而在正丁醇相的处理中未检出AFB1，可见，正丁醇萃取物能有效抑制AFB1的产生。

表2 油茶籽粕不同溶剂萃取相对黄曲霉菌产毒的影响Table 2 Contents of AFBs of three extract phases at different concentration萃取相Extract phase浓度Concentration/(mg·mL-1)黄曲霉毒素质量分数AFBs content/(μg·kg-1) AFB1AFB2 乙酸乙酯相Ethyl acetate 正丁醇相n-butanol phase25NDND 33.3NDND 50NDND 100NDND 水相Aqueous 100NDND 对照

AFB1含量和菌丝生长的相关性分析结果表明，AFB1含量和抑菌圈直径呈显著负相关（r=?0.937 6，P=0.002 1），与菌丝干质量呈显著正相关（r=0.581 0，P=0.005 8）。可见，油茶籽粕80%甲醇提取物的正丁醇萃取相能有效抑制黄曲霉菌的生长和AFB1产生。

2.1.4 抑菌物质的初步确定

对正丁醇和乙酸乙酯两种溶剂进行了抑菌试验，结果发现（表3），二者对黄曲霉菌无明显的抑制效果，由此可以排除正丁醇和乙酸乙酯这2种溶剂本身对试验结果的干扰。此外，前人研究发现油茶籽粕正丁醇提取物中的主要化学成分是茶皂素[21-22]，对油茶籽中提取的茶皂素的抑菌结果见表3，茶皂素对黄曲霉菌无抑制效果。由此推测对黄曲霉菌起抑制作用的是正丁醇萃取物中的其他活性成分，有必要进一步对正丁醇萃取相进行纯化和鉴定。

表3 正丁醇、乙酸乙酯、正丁醇萃取相和茶皂素的抑菌效果对比Table 3 Inhibitory effect of n-butanol solvent, ethyl acetate solvent, n-butanol phase and purified tea saponin on A. flavus溶液浓度Content/(mg·mL-1)抑菌圈直径Inhibition zone diameter/mm菌丝干质量Mycelial dry weight/g 正丁醇萃取相n-butanol phase2515. 33.316. 5018. . 茶皂素纯品Purified tea saponin25ND0. 33.3ND0. 50ND0. 100ND0. 正丁醇溶剂n-butanolND0. 乙酸乙酯溶剂Ethyl acetateND0.

2.2 正丁醇萃取相梯度洗脱物的抑菌效果

2.2.1 对抑菌圈直径的影响

由表4可见，正丁醇相的各洗脱物中，75%乙醇洗脱物对黄曲霉菌生长有明显的抑制效果，在50和100 mg/mL时抑菌圈直径分别为146.6和163.7 mm，且二者呈极显著差异（P<0.01），在25 mg/mL时未出现抑菌圈，可见其最小抑菌浓度为50 mg/mL。其余各洗脱物对黄曲霉菌生长均无抑菌效果，未出现抑菌圈。

表4 正丁醇萃取相各洗脱物对黄曲霉菌的抑制效果Table 4 Inhibitory effect of different eluants in n-butanol extraction phase on A. flavus洗脱物种类Eluent type抑菌圈直径Inhibition zone diameter/mm 25 (mg·mL-1)50 (mg·mL-1)100 (mg·mL-1) 水洗脱物Pure water eluentNDNDND 25%乙醇洗脱物25% alcohol eluentNDNDND 50%乙醇洗脱物50% alcohol eluentNDNDND 75%乙醇洗脱物75% alcohol eluentND146. 100%乙醇洗脱物100% alcohol eluentNDNDND

2.2.2 对菌丝干质量的影响

液体培养过滤后菌丝质量结果显示（图2），与对照相比，水洗脱物对黄曲霉菌丝生长无抑制作用甚至会促进生长，25%乙醇洗脱物和50%乙醇洗脱物对黄曲霉菌菌丝生长有少量的抑制作用但效果不显著（P>0.05），100%乙醇洗脱物基本无抑制作用；75%乙醇洗脱物对黄曲霉菌的菌丝生长有显著的抑制作用（P<0.01），且浓度越大，菌丝生长量越低，这一结果与固体培养结果一致。

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