油茶籽饼粕中甲醇提取物抑制黄曲霉菌效果及成(2)

1.5 不同溶剂萃取相的抑菌效果

乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分别称质量1 g溶解于10 mL无菌水，配成100 mg/mL的溶液，再依次稀释成50、33.5、25 mg/mL，用0.22 μm醋酸纤维膜过滤[18]备用。

1.5.1 抑菌圈法

采用改良的牛津杯法[19]。用无菌吸管吸取100 μL黄曲霉孢子悬液（1.0×106 孢子/mL）到PDA平板表面，涂布均匀。取3个内径6 mm的牛津杯轻置于平板表面。每个杯体内加入200 μL不同浓度的乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相，静置15 min，用封口膜固定培养皿，于4 ℃放置12 h使提取液充分扩散，取出后置于29 ℃培养箱培养，48 h后测量抑菌圈直径，每处理重复3次，以无菌水作对照。

1.5.2 菌丝干质量法

吸取200 μL的1×106/mL孢子菌悬液，加入装有20 mL已灭菌的PDB培养基的三角瓶中，加入1%吐温80使黄曲霉孢子均匀分散，再分别添加200 μL不同浓度的乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相，使最终浓度分别为100、50、33.5、25 mg/mL，每个浓度梯度做3个重复，于29 ℃、180 r/min恒温摇床培养5 d后取出，用滤纸过滤，挑出菌丝于45 ℃烘箱内烘干至恒质量，称量、计算菌丝干质量。保留滤液，用于测定黄曲霉毒素[20]。

1.5.3 黄曲霉毒素含量测定

1.5.2所得滤液经酶联免疫亲和柱净化处理后测定黄曲霉毒素，测定方法参考GB （第一法）。液相色谱条件：Symmetry C18柱（150 mm×3.9 mm，5 μm）。流动相A：0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸铵, 流动相B：乙腈；柱温：35 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；梯度洗脱：0 min，50%B；2 min 60% B；6～7 min，100% B；10～12 min，50% B。质谱条件：电喷雾离子源负离子模式（ESI+）；毛细管压力：3.0 kV；离子源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流量：650 L/h；锥孔气流量：50 L/h；扫描方式：多反应监测MRM。

1.6 正丁醇萃取相分离纯化和抑菌效果

采用柱色谱法。称取15 g正丁醇萃取物，加入50 mL蒸馏水，充分溶解后经AB-8大孔树脂柱层析，依次用2倍柱体积的乙醇水洗脱体系（蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、100%乙醇）洗脱，流速为20 mL/min，分别收集各部分洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥得到5种洗脱物。

分别称质量1 g上述5种洗脱物溶解于10 mL无菌水中，配成100 mg/mL的溶液，再依次用无菌水稀释成50和25 mg/mL，用0.22 μm醋酸纤维膜过滤[18]。采用抑菌圈法和菌丝干质量法，再测定黄曲霉毒素含量，具体方法同1.5.1、1.5.2和1.5.3。

1.7 活体上的验证试验

用75%乙醇对玉米和花生籽粒进行表面消毒，粉碎成较大颗粒，用无菌水调节含水量至20%以上，装入培养皿，接种1 mL黄曲霉孢子悬液（1.0×106 mL），再加入100 mg/mL75%乙醇洗脱物，混匀，以等量的无菌水作为对照，每隔24 h检测黄曲霉菌的生长情况，5 d后测定黄曲霉毒素含量。

1.8 75%乙醇洗脱物中的活性物质鉴定

将75%乙醇洗脱物用50%甲醇（体积比）溶解配制成浓度5 mg/mL，于10 000 r/min离心20 min，取上清液进飞行时间液质联用仪检测。液相条件：流动相A：0.1%（体积比）甲酸-水溶液，流动相B：0.1%（体积比）甲酸乙腈；流速0.8 mL/min；检测波长280 nm；色谱柱为ZORBAX-SBC18（100 mm×4.6 mm（i.d.），1.8 μm，安捷伦公司）；进样量5 μL；柱温30 ℃。质谱条件：电喷雾离子源负离子模式（ESI-），扫描范围m/z 100～1 500；雾化气（GS1）50 psi；雾化气（GS2）50 psi；气帘气（CUR）35 psi；离子源温度550 ℃；离子源电压（IS）：?4 500 V。检索谱库：Scifinder、Reaxy数据库。

1.9 数据分析

所有数据采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0统计软件进行数据处理和分析，用t检验法进行显著性检测，P<0.05，认为存在显著性差异。试验结果采用平均值±标准误的形式表示。

2 结果与分析

2.1 油茶籽粕不同溶剂萃取相的抑菌效果

2.1.1 对抑菌圈直径的影响

本研究采用80%甲醇、乙酸乙酯、正丁醇依次对油茶籽粕进行梯度萃取，每种溶剂的萃取得率有所不同（表1），乙酸乙酯相得率最低，仅2.44%，其次是水相，得率为16.61%，正丁醇的极性最大，其萃取得率最高，为30.25%。

表1 油茶籽粕不同溶剂萃取相的得率和抑菌效果（抑菌圈直径）Table 1 Diameter of inhibition zone of sequential extraction of different solvents at different concentrations萃取相Extract phase萃取得率Extractability /%抑菌圈直径Inhibition zone diameter/mmANOVA 25 (mg·mL-1)33.3 (mg·mL-1)50(mg·mL-1)100(mg·mL-1) 乙酸乙酯相Ethyl acetate phase2. 正丁醇相n-butanol phase30.<0.01 水相Aqueous phase16.

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