银杏种子萌发过程低场核磁T2反演谱解译初探

0 引 言

银杏（Ginkgo Biloba L.）是原产于中国的珍贵树种之一，其叶具有极高的药用和经济价值[1-4]，现已大量推广种植。银杏主要的繁殖方法有播种、扦插、嫁接、分蘖等，由于实生苗叶总萜内脂和黄酮含量高[5]，叶用银杏常采用播种繁殖。研究银杏种子萌发过程中的水分状态分布以及成分含量变化，对探究其萌发机理、指导科学种植具有重要意义。

低场核磁共振技术（Low Field Nuclear Magnetic Resonance，LF-NMR）的横向弛豫时间（Transverse Relaxation Time，T2）反演谱检测可以快速、无损地获知样品内水分含量和相态分布情况，已广泛运用于食品[6-9]、环保[10]、材料[11-12]、地质[13-14]等领域。T2反演谱检测在种植业也成为了重要的研究手段，宋平等[15]通过LF-NMR技术动态监测玉米种子的萌发过程，研究其内部各相态水分的流动规律和生理代谢状态；杨洪伟等[16]利用T2弛豫谱和质子密度加权成像分析在聚乙二醇处理下水稻种子萌发过程内部水分分布和变化规律；牟红梅等[17]结合T2弛豫谱和质子密度加权成像分析，对冬小麦籽粒进行连续活体检测，揭示了小麦灌浆过程水分变化规律。国外学者也利用T2反演谱对植物萌发过程进行了诸多研究[18-21]。但目前对T2反演谱的解译仅停留在水分相态分布的层面，未能将其与检测对象的化学组分建立关联。

为突破当前对T2反演谱解译的局限，本文以银杏种子为研究对象，通过低场核磁共振技术，检测并分析鲜种、种子粉末及其主要成分试样的T2反演谱，探究各信号峰的形成机理，拟提出一种从物质成分角度对种子萌发过程中T2反演谱的变化进行解译的新方法。

1 材料与方法

1.1 试验设备

本文主要设备为MesoMR23-060H-I在线低温核磁共振分析与成像系统（苏州纽迈分析仪器股份有限公司）、RXZ-500B人工气候箱（宁波江南仪器厂）、Allegra 64R台式高速离心机（贝克曼库尔特有限公司）、DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、JA1003电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；麦芽糖购自上海源叶生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯试剂，另索氏提取器、玻璃试管、培养盒、吸水纸若干。

试验采用的银杏种子取自江苏省邳州市银杏良种基地，品种为道真5号，于2018年10月采摘后带皮储藏。2019年3月，在种子完成生理后熟后，洗去外种皮，晾干表面水分并挑选出颗粒饱满、大小和质量相近的银杏种子。选取20颗用于萌发试验，其余种子备用。

1.2 试验方法

1.2.1 主要成分提取

参照GB [22]提取银杏种子粗脂肪。通过碱溶酸沉法获得粗银杏种子蛋白质[23]，并参照文献[24-25]的方法提取淀粉。将去壳去皮的银杏种子在40 ℃下烘干后粉碎，过400目筛。采用正己烷脱脂（种子粉末：正己烷=1:8（质量/体积）），4 ℃下低速搅拌1 h后抽滤，重复2次。将脱脂后的种子粉末分散在蒸馏水（10%，质量/体积）中，使用1 mol/L的NaOH将pH值调节至9.0，并在室温下搅拌30 min，以8 500 r/min的转速离心15 min，收集上清液用于提取蛋白质，并刮除沉淀物表面绿色蛋白质层（剩余部分即淀粉）。重复上述操作，直至沉淀物表面无绿色蛋白质层。将淀粉用1 mol/L的HCl中和至pH值7.0，使用鼓风干燥箱在40℃下干燥24 h，研磨后过150目筛，在室温下保存备用。将上清液用1 mol/L的HCl酸化至pH值4.4，通过离心回收沉淀物，用1 mol/L的NaOH中和至pH值7.0，经冷冻干燥后获得银杏种子蛋白质。

1.2.2 T2弛豫谱检测与反演

将样品置入探头线圈后，首先通过核磁共振分析应用软件中的FID（Free Induction Decay）脉冲序列自动寻找90°脉宽P1，并校正中心频率O1，再选择CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脉冲序列检测T2弛豫谱。主要参数设置如下：90°脉宽P1=6 μs，180°脉宽P2=12 μs，回波时间TE=0.25 ms，回波个数NECH=15 000，累加次数NS=12，模拟增益RG1=20 dB，数字增益DRG1=3，前置放大倍数PRG=1，频率漂移O1每次检测时自动校准。T2弛豫谱检测完成后，通过分析软件自带的SIRT方法进行反演，迭代次数设置为1 000 000。对每组样品进行3次连续的信号采集，取均值进行分析。

1.2.3 银杏种子萌发试验

本文的研究目的在于建立种子主要成分与T2反演谱之间的关联，而银杏种子的主要成分种类均相同，因此种子个体间的差异不对本文研究造成影响。本文选用20颗种子分为10组（每次检测2颗种子的共同信号）进行萌发试验，期间进行称质量及T2反演谱检测。设定第一次检测的时间为0 h，检测完成后把种子埋入盛有湿沙（相对湿度60%～80%）的培养盒中，放进人工气候箱，温度设定为30 ℃[26]，湿度100%，光照12 h/d。每隔24 h将种子取出，洗去沙粒后用吸水纸擦拭掉表面的水分，静置5 min后重复上述检测，记录下种子在萌发过程中各个时刻的质量（认为种子增加的质量源于吸收的水分）、T2反演谱。检测完成后立即将种子埋入培养盒，并适量浇水，保证种子在萌发的过程中有充足的水分。萌发试验进行到胚根长出体外2 mm左右。根据式（1）计算出种子在萌发过程中各时间点的吸水率WA[27]，并绘制吸水率变化曲线（仅用于寻找本研究中种子萌发过程吸水规律发生明显变化的时间节点，作为T2反演谱变化过程中的典型时刻）。

文章来源：《种子科技》 网址: http://www.zzkjzz.cn/qikandaodu/2021/0120/806.html